Tras la reconquista de la ciudad por la Orden de Santiago, y su posterior entrega como señorío, se construye la primitiva iglesia mudéjar, con características constructivas similares a la iglesia del Monasterio de Santa Clara. Esta iglesia, tenía unas dimensiones menores que la actual, ubicándose en la superficie rectangular delimitada entre las actuales puertas laterales de entrada, hasta la torre en el frontal de la iglesia, aunque con un cierto giro respecto a la actual. Disponía de tres naves, capillas y dependencias auxiliares.^[5]​

El descubrimiento de América tuvo un impacto extraordinario en el contexto social y económico de Moguer, y muy en particular en su parroquia, una de las instituciones más beneficiadas por la emigración de los moguereños. De las aproximadamente 77 capellanías fundadas en el XVI en esta iglesia mayor, un gran número fueron instituidas directamente por indianos y por parientes de residentes moguereños en Indias, que escogieron la iglesia parroquial como lugar de enterramiento.

Ubicación primitiva iglesia sobre planta actual.

Entre los indianos que fundaron capellanías nos encontramos con las dos del capitán Pedro Montes Doca, cuya lápida sepulcral aún se conserva junto al umbral de la puerta principal; las dos del arcediano de Cuzco Juan Alonso Cota; o las de Fray Francisco Ruiz, dominico residente en la ciudad de Los Reyes (Perú), Juan Vanegas, fallecido en Panamá, Antón Quintero, fallecido en la isla de Santo Domingo; Francisco Ruiz Tirado, fallecido en Panamá; la de Catalina Rodríguez la Ximona, fallecida en Yaguana, isla de Santo Domingo; la de Pedro Benítez Camacho, rico propietario con hacienda en la ciudad de La Plata: o la de Alonso Ruiz de Abrego, residente también en la ciudad de La Plata (Perú). Todos ellos dotaron sus capellanías en la parroquia de Moguer con fuertes sumas de dinero enviadas desde las Indias. Otros envíos y donaciones de moguereños ausentes en diversas partes del continente americano sirvieron para enriquecer la hacienda y el patrimonio artístico de la parroquia, e incentivar igualmente la economía de su numeroso clero.

En el embellecimiento de la primitiva parroquia trabajaron artistas de renombre: los retablos de las capillas del Arcediano y de Antón García Vanegas fueron realizados por Juan de Oviedo, Pedro de Villegas y Juan de Saucedo, obras contratadas en 1575 y 1577 respectivamente; el retablo mayor con la imagen de la Virgen de la Granada, como titular, iniciado por Miguel Cano y concluido por los hermanos Ribas (sustituido en 1783 por un baldaquino de Tomás Santizo^[6]​), y una amplia relación de objetos artísticos acumulados durante siglos: pintura, imaginería, orfebrería, ornamentos, patrimonio documental, la sillería del coro tallada en caoba, el espléndido órgano situado en la cabecera detrás del templete, los catorce retablos barrocos distribuidos por el templo, etc; que fueron expoliados, destruidos o desaparecidos con el saqueo de las tropas francesas en marzo de 1810, las desamortizaciones, y sobre todo la guerra civil de 1936.

En el siglo XVIII, tras los importantes daños sufridos por el terremoto de Lisboa de 1755, fue reconstruida sobre los restos de la antigua iglesia mudéjar del siglo XIV, pese a que en un primer momento se procedió a la restauración del edificio original. Según se desprende del informe emitido por Pedro de San Martín, maestro mayor de obras del Arzobispado de Sevilla, después de visitar el edificio en abril en 1756, se estima el coste de las reparaciones en 22.500 reales de vellón. El arzobispo de Sevilla, teniendo presente la futura división de su archidiócesis de Sevilla en la zona, y el peso socioeconómico del municipio en ese momento, encargó a Pedro de San Martín (maestro mayor de obras del arzobispado), la construcción de una catedral, como futura sede del obispado que debía surgir en la zona.^[5]​^[7]​